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作者：博醫(yī)康來源：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 發(fā)表日期：2015年3月22日 11:45

【摘要】  本研究探討冷凍干燥保存血小板的方法集成，以獲得可長期凍干保存的血小板制品技術創新，使之能在常溫條件下保存、占用空間小、重量輕不可缺少、便于長距離運(yùn)輸，能夠滿足突發(fā)事件和戰(zhàn)傷救治的需要形式。在冷凍干燥保存過程中添加血小板可逆性激活抑制劑長足發展、DMSO和海藻糖等低溫保護(hù)劑，進(jìn)行預(yù)處理問題、冷凍逐漸顯現、一級(jí)干燥、二級(jí)干燥系統穩定性，再水化拓展基地，并同時(shí)測定血小板回收率，凝血酶聚集反應(yīng)實力增強，促凝血功能不合理波動，CD62p表達(dá)率和PAC1表達(dá)率等。結(jié)果表明：血小板回收率為56.29％重要工具，其對(duì)凝血酶的聚集反應(yīng)與對(duì)照組無明顯差異積極拓展新的領域，對(duì)ADP和丙基沒食子酸誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)較對(duì)照組分別降低49.34％和26.25％，促凝血功能與對(duì)照組比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異更優質；凍干血小板CD62p表達(dá)率為42.36％相對開放，PAC1表達(dá)率為2.12％，凝血酶激活后CD62p再表達(dá)率為50.88％脫穎而出，PAC1再表達(dá)率為54.55％溝通機製。結(jié)論：添加血小板可逆性激活抑制劑，海藻糖和DMSO后的凍干血小板註入新的動力，其聚集活性和促凝血功能與新鮮血小板無明顯差異領先水平，血小板可逆性激活抑制劑降低了凍干血小板的CD62p表達(dá)，增強(qiáng)了凍干血小板的生存能力雙重提升，因而延長了其生存時(shí)間戰略布局，因此可以該凍干方法為基礎(chǔ)進(jìn)一步提高凍干保存血小板的效率。

【關(guān)鍵詞】  可逆性激活抑制劑

     Experimental Study on Lyophilization of Plaets

       Abstract    The aim of this study was to search a procedure of plaet lyophilization and find a way of longterm sto rage of human plaets at normal temperature with smaller  size and lighter weight, to be convenient to transport at long distance thus to meet the demands in accidents and war time. Human plaets were pretreated  by freezing,  the first and  the second desiccation, and  were added with reversible activationinhibitors of plaets, DMSO and trehalose, then were rehydrated.  At the same time,  the recovery rate of plaets, plaet maximal aggregation induced by thrombin, coagulation of plaets, CD62p expression and PAC1 expression were assayed.   The results indicated that the recovery rate of the plalelets was 56.29%. The  plaet maximal aggregation induced by thrombin had no significant difference between lyophilized plaets and  the fresh plaetrich plasma (FPRP), but the aggregation of plaets   induced by ADP or propyl gallate was decreased by 49.34% and 26.25%. Coagulation of the lyophilized plaets  was  not significantly different from FPRP. CD62p expression of the lyophilized plaets  (42.36％)  was higher than  that in  FPRP while PAC1 expression was 2.12%. CD62p reexpression rate induced by thrombin was 50.88% and PAC1  reexpression was 54.55%.  It is concluded that the ability of recovered lyophilized plaets added with reversible activationinhibitors, DMSO and trehalose  to aggregate and coagulate has showed  no significant difference  as compared with  FPRP. The reversible activationinhibitors can decrease CD62p  expression of lyophilized plaets, and may enhance their  survival ability   and  prolongate survival time. Therefore the efficiency of lyophilizing plaets can  be  improved based on  this freezedrying procedure.

    Key words    plaet; lyophilization; activationinhibitor; trehalose; DMSO

       由于凍干制品能在常溫下保存表現明顯更佳、性能穩(wěn)定狀態、便于運(yùn)輸技術節能，因而冷凍干燥技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種生物材料的保存。目前的血小板保存方法使其應(yīng)用和運(yùn)輸受到很大的限止廣泛認同，凍干是血小板的保存方法國際要求，凍干的血小板能在常溫條件下保存、占用空間小鍛造、重量輕競爭激烈、便于運(yùn)輸?shù)龋绕淠軕?yīng)付突發(fā)事件以及戰(zhàn)場救治的需要改善。因此空白區，凍干保存血小板的研究幾十年來一直吸引著各國學(xué)者的關(guān)注。本研究利用海藻糖是目前主流、可逆性血小板功能抑制劑和二甲亞砜等低溫保護(hù)劑充分發揮，冷凍干燥保存血小板，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下充分發揮。

    材料和方法

    血小板來源

    血小板取自自愿供血者選擇適用。自愿供血者獻(xiàn)血前1天內(nèi)禁飲含酒精類飲料，2周內(nèi)未服用阿司匹林等抗血小板及抗凝血的藥物設計。應(yīng)用COBE Spectra血液分離機(jī)采集濃縮血小板（PCs）業務指導。

    主要試劑及溶液

    試劑  植酸鈉（Phylocid sodium, Sigma公司產(chǎn)品），百維利肽（Bivalirudin, Medicine公司產(chǎn)品）左旋精氨酸（Larginine, Sigma公司產(chǎn)品）就此掀開，PGE1（商品名保達(dá)新）長足發展、海藻糖（trehalose)購自南寧中諾生物工程公司）、二甲亞砜（DMSO穩步前行，天津醫(yī)藥公司產(chǎn)品）結構不合理。熒光素標(biāo)記的特異性血小板膜表面抗體及相關(guān)多肽：PAC1－FITC， CD62P－PE各有優勢，CD61－PerCP效果較好，MIgGI－PE等購自Becton Dickinson公司；RGDS肽和GPRP （GlyProArgPro乙酸鹽）購自Sigma公司產(chǎn)品持續。血小板聚集誘導(dǎo)劑包括：凝血酶（thrombin等多個領域，  Sigma公司產(chǎn)品），二磷酸腺苷（ADP產品和服務， Sigma公司產(chǎn)品）應用擴展，丙基沒食子酸（Propyl gallate， Analytical ControlSystems公司產(chǎn)品）增多。

    MEK6108K型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（Nihon Kohden公司產(chǎn)品）活動上，APACT2聚集儀（德國Lanbo公司產(chǎn)品），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司產(chǎn)品）和CellQuest分析軟件， Centrifuge 5415D離心機(jī)（Eppendorf）生產能力，Biofuge15R（Heraeus公司產(chǎn)品）標準，臺(tái)式冷凍干燥機(jī)（TFFD1）示範推廣。

    實(shí)驗(yàn)分組

    實(shí)驗(yàn)為配伍設(shè)計(jì)堅持好，5份PCs，各準(zhǔn)備15 ml大幅增加。設(shè)對(duì)照組和2個(gè)實(shí)驗(yàn)組特性，對(duì)照組為新鮮富含血小板血漿（FPRP），不進(jìn)行任何處理等特點。每份PCs分3個(gè)試管建言直達，2ml/tube，分至各組將進一步，剩余的離心（2 287×g,15分鐘）充分發揮，留取少量血小板血漿（PPP）備用。

    前處理（海藻糖負(fù)載）

    血小板中加入預(yù)處理液成就，實(shí)驗(yàn)組1含海藻糖 45 mmol/L和DMSO 3%重要方式，實(shí)驗(yàn)組2含海藻糖 45 mmol/L，DMSO 3%系統，PGE1 1 μmol/L非常重要，LArg 5 mmol/L，Phy 0.5 mmol/L和Bivaridin 0.5 μmol/L空間廣闊。將各組樣品混勻后營造一處，37℃水浴4小時(shí)，每20分鐘振搖1次增強。

    血小板冷凍干燥重要意義、預(yù)水化和再水化

    血小板懸液1 111×g離心8分鐘，用冷凍干燥液1 ml（HEPES 9.5 mmol/L更加廣闊，NaCl 142.5 mmol/L規劃，KCl 4.8 mmol/L，MgCl2 1.0 mmol/L方便， trehalose 150.0 mmol/L基礎上，PGE1  1 μmol/L， LArg 5 mmol/L應用領域，Phy 0.5  mmol/L保持競爭優勢， Bivaridin 0.5 μmol/L，DMSO 3%發展機遇，人血清白蛋白 5%）在硅化后的玻璃瓶中重懸血小板長效機製，血小板PCT為40%-50%，干燥厚度<1 cm，進(jìn)行冷凍干燥分享。

    冷凍  ①以5℃/分鐘的速度從22℃降至-5℃共享； ②以2℃/分鐘從-5℃降至-60℃;  ③ -60℃以下維持1小時(shí)以上。

    干燥  一級(jí)干燥方式之一，－30℃生動，1小時(shí)，50 mTorr創新能力；二級(jí)干燥新品技，架上溫度以0.2℃/分鐘的速度從-30℃升至20℃，50 mTorr求得平衡。一級(jí)干燥和二級(jí)干燥之間采用快速直接升溫紮實做，避免梯度升溫。真空干燥完畢后至關重要，樣品室溫下在凍干機(jī)中至少放置24小時(shí)提供深度撮合服務，然后用于試驗(yàn)或封裝保存室溫或4℃放置。

    預(yù)水化  凍干的血小板在37℃濕度飽和的密閉環(huán)境中水浴4小時(shí)的發生，使水含量達(dá)25％左右組成部分。

    再水化  預(yù)水化處理后，按1∶4進(jìn)入等滲的復(fù)水液/H2O（3/1, V/V）中再水化狀態。復(fù)水液含NaCl 116.0 mmol/L等形式，枸櫞酸鈉 13.6 mmol/L，Na2HPO4  8.6 mmol/L研究與應用， KH2PO4 1.6 mmol/L飛躍， EDTA 0.9 mmol/L，葡萄糖 11.1 mmol/L全面協議，PGE1 1μmol/L重要部署，LArg 5 mmol/L，Phy 0.5 mmol/L工具，Bivaridin 0.5 μmol/L智慧與合力，DMSO 3%，pH=6.8重要的角色。

    血小板回收率

    血小板回收率=（復(fù)水后血小板數(shù)目／凍干前血小板數(shù)目）×100％

    血小板聚集試驗(yàn)

    各誘導(dǎo)劑作用濃度為thrombin 1 U/ml開放要求，ADP 20 μmol/L， propyl gallate 50 μl平臺建設。PPP聚集率為0%服務機製，PRP聚集率為100％。原血漿調(diào)整PRP血小板濃度至(200-300)×106/ml使用，反應(yīng)體積250 μl大幅拓展。

    血小板膜表面CD62p發行速度、PAC1的表達(dá)率

    采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測定血小板膜表面CD62p、PAC1d陽性表達(dá)率與時俱進，操作參照常規(guī)檢查步驟性能。以CD61表達(dá)和SSC作為選定血小板的條件R1，獲取10 000個(gè)血小板（速度300個(gè)/秒）進(jìn)行FL1（PAC1－FITC）和FL2（CD62p－PE）雙參數(shù)分析綜合運用。以陰性對(duì)照管供給，調(diào)節(jié)陽性區(qū)的假陽性率<1％，用單純血小板和各陽性單染（抗CD61單染效果較好，抗CD62p單染和抗PAC1單染對(duì)照）加陰性對(duì)照校正熒光FL1重要的意義，F(xiàn)L2持續。建立獲取模式后檢測測定管等多個領域。